RESUMEN
Introducción La enfermedad CLN8 es uno de los 13 tipos genéticos reconocidos de lipofuscinosis neuronal ceroidea, un grupo de trastornos neurodegenerativos de acumulación lisosómica, los más frecuentes en la infancia. La causan mutaciones en la proteína transmembrana CLN8 de 286 aminoácidos, cuya función se desconoce. Las variantes patológicas en el gen CLN8 se asociaron con dos fenotipos diferentes: la variante infantil tardía en individuos de diversos países alrededor del mundo, y la epilepsia progresiva con retraso mental, que aparece en pacientes finlandeses y turcos. Caso clínico Niña que mostró retraso psicomotor y demencia desde el nacimiento, convulsiones tonicoclónicas, mioclonía, ataxia con atrofia cerebelosa y muerte temprana a los 12 años. La microscopia electrónica de la piel mostró una mezcla de citosomas con patrones de depósitos osmiofílicos granulares, curvilíneos y de «huella digital», y mitocondrias hipertrofiadas. Se encontraron dos variantes patológicas de ADN en el gen CLN8 (exón 2 c.1A>G; p.?/ exón 3 c.792C>G; p.Asn264Lys), lo que confirmó un genotipo heterocigoto compuesto. Conclusión Éste es el caso índice en América Latina para el nuevo fenotipo congénito de la enfermedad CLN8. La sospecha de esta patología debería sustentarse genéticamente en casos de síndrome neurodegenerativo con retraso psicomotor desde el nacimiento, dificultad del habla y convulsiones. El curso clínico incluye ataxia, atrofia cerebelosa y muerte temprana.
Palabras claveAmérica LatinaCaso índiceEnfermedad CLN8Fenotipo congénitoLipofuscinosis neuronal ceroideaMutación heterocigota compuesta

TEXTO COMPLETO

Introducción
La enfermedad CLN8 es una de las 13 formas genéticas reconocidas de lipofuscinosis neuronal ceroidea, un grupo de trastornos neurodegenerativos hereditarios de acumulación lisosómica. Está causada por variantes en el gen CLN8 (MIM *607837) [1], el cual codifica para la proteína transmembrana CLN8 (CLN8p) de 286 aminoácidos, residente en el re­tículo endoplásmico [2]. El papel de CLN8p aún se desconoce; sin embargo, se ha asociado con lípidos [3]. Dos fenotipos están relacionados con mutaciones en el gen CLN8: epilepsia progresiva con retraso mental (EPRM), también conocida como síndrome de epilepsia del norte (OMIM 610003) [4], y una variante infantil tardía (vIT) (OMIM 600143) [5]. Las principales características de ambas variantes se resumen en la tabla. Ningún caso de CLN8 se ha descrito hasta la actualidad en América Latina, ni tampoco los fenotipos congénitos, infantil o adulto.

Tabla. Comparación de las historias naturales de los fenotipos congénito, vIT y EPRM de CLN8.

Congénito

vIT

EPRM

Origen

Argentina

Varios países alrededor del mundo

Finlandia y Turquía

Edad de inicio

Nacimiento

2-7 años

5-10 años

Síntomas iniciales

Retraso psicomotor, dificultades del
			habla

Convulsiones, mioclonías o deterioro psico-motor generalizado

Convulsiones tonicoclónicas

Síntomas

Convulsiones refractarias

Sí

Sí

Sí

Mioclonías

Sí

Sí

No

Deterioro motor

Sí

Sí

Sí

Discapacidad intelectual

Sí

Sí

Sí

Fallos en la visión

?

Sí

No

Resonancia magnética

Atrofia
			cerebelosa

Atrofia cortical
			y cerebelosa

Atrofia cortical
			y cerebelosa

Microscopía óptica

Sin linfocitos
			vacuolados

–

Neuronas globulares
			sin vacuolas

Microscopía electrónica
			de transmisión

Cuerpos en ‘huella digital’, cuerpos curvilíneos, GROD y atrofia mitocondrial

Cuerpos en ‘huella digital’, cuerpos curvilíneos y raramente GROD

GROD

Edad de fallecimiento

12 años

Generalmente, antes de los 20 años

Generalmente, después de los 50 años

Variantes genéticas
			patológicas descritas

c.1A>G, p.?
			c.792C>G, p.Asn264Lys

Más de 30 mutaciones descritas

c.70C>G, p.Arg24Gly
			c.677T>C, p.Leu226Pro

EPRM: epilepsia progresiva con retraso mental; GROD: depósitos osmiofílicos granulares; vIT: variante infantil tardía.

El objetivo de este trabajo es resignificar el valor de un enfoque clínico y genómico en el esclarecimiento de un caso de una enfermedad neurodegenerativa poco frecuente desde el nacimiento.
Los procedimientos desarrollados estuvieron de acuerdo con la Declaración Universal de Derechos Humanos y Bioética de la Unesco de 2005, y la abuela (tutora) firmó un consentimiento informado aprobado por el Comité Interinstitucional de Ética de la Investigación en Salud (CIEIS-Córdoba, Argentina).

Caso clínico
Una de dos mellizas argentinas de padres no consanguíneos falleció a los 12 años. La madre murió debido a una cardiopatía y el padre abandonó la familia un tiempo antes de la consulta médica. La ni­ña mostró retraso psicomotor y demencia desde el nacimiento, y convulsiones tonicoclónicas desde los 3 años. Pudo caminar sola a los 2 años y nunca desarrolló completamente el habla. Los exámenes de resonancia magnética y tomografía axial computarizada a los 6 años revelaron atrofia cerebelosa (Fig. 1). A los 7 años, la niña mostró ataxia grave, temblores y caídas constantes, y retraso neuromadurativo importante, aunque se mantenía conectada con sus tutores. Los estudios neurometabólicos realizados en CEMECO (ensayos cualitativos de oligosacáridos urinarios y aminoácidos plasmáticos, y mediciones cuantitativas de ácidos orgánicos urinarios) arrojaron resultados en el rango normal, y también los ensayos enzimáticos para palmitoil proteína tioeste­rasa 1 (PPT1; EC 3.1.2.22) y tripeptidil peptidasa 1 (TPP1; EC 3.4.14.9). Se observaron a los 9 años convulsiones cortas intratables, mioclonías, caídas atónicas, hiperreflexia osteotendinosa y clonía bilateral espontánea inextinguible en los pies y las manos. La biopsia de piel reveló glándulas secretorias ecrinas con acumulación de pigmentos tipo lipofuscina-ceroidea agrupados en depósitos osmiofílicos granulares, perfiles de ‘huella digital’ y cuerpos curvilíneos (Fig. 2). Estos hallazgos caracterizan la patología de lipofuscinosis neuronal ceroidea.

Figura 1. Imágenes de resonancia magnética de la paciente a los 6 años. Se observa una formación quística en la fosa posterior que, según se revela en el plano sagital, parece conectarse con el cuarto ventrículo y se asocia con la dilatación del sistema ventricular supratentorial, que podría relacionarse con una variante del síndrome de Dandy-Walker.

Figura 2. Imágenes de microscopía electrónica de transmisión en una biopsia de piel. a, b) Diferentes perfiles de acumulación asociados con gránulos de lípidos; frecuentemente se observan mitocondrias hipertrofiadas en microscopía electrónica de transmisión de pacientes CLN8; c, d) Perfiles mixtos asociados con gránulos de lípidos; e, f) Perfiles mixtos asociados con mitocondrias vacuoladas hipertrofiadas; g) Gran número de mitocondrias hipertróficas; h) Citosoma con una acumulación compuesta de GROD. CB: cuerpos curvilíneos; FP: cuerpos en ‘huella digital’; G: aparato de Golgi; GROD: depósitos osmiofílicos granulares; L: gránulo de lípidos; M: mitocondria; N: núcleo; PM: membrana plasmática.

Algoritmo diagnóstico
Este trabajo es parte del estudio observacional de cohorte de la distribución de lipofuscinosis neuronal ceroidea en la población argentina. El estudio diagnóstico de todos los pacientes incorporados al Programa de Investigación Traslacional de Lipofuscinosis Ceroidea Neuronal en Argentina se realizó siguiendo el algoritmo previamente publicado [6]. Los métodos de microscopia electrónica de transmisión y ensayo enzimático se publicaron previamente [6-9].
Análisis genómicos
Se aisló ADN genómico de la sangre periférica usando Wizard DNA Purification Kit (Promega, Estados Unidos) siguiendo el protocolo del producto. La región codificante del gen CLN8 se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa (oligos disponibles bajo pedido). Las secuenciaciones se realizaron en el University of Chicago Comprehensive Cancer Centre (Chicago, Estados Unidos) y en el Laboratorio de Diagnóstico Neurogenético del Centre for Human Genetic Research, ambos en un secuenciador Applied Biosystems 3730XL. Todas las secuencias controles del gen CLN8, tanto humano (RefSeq NM_018941, NP_061764) como de otras especies, fueron obtenidas de la base de datos Ensembl v. 90. Las variantes de ADN fueron excluidas de 100 individuos sanos de la población local (muestras provistas amablemente por el banco de sangre de la Universidad Nacional de Córdoba) usando el programa MEGA v. 5.05 [10] para los alineamientos. Las variantes proteínicas no sinónimas fueron validadas como de significación patológica por evaluación con los programas SIFT [11], PolyPhen [12] y Mutation Taster. Las variantes no codificantes fueron analizadas usando el programa RESCUE-ESE [13,14].
Las secuenciaciones mostraron los cambios c.1A>G en el exón 2 y c.792C>G en el exón 3, ambos en estado heterocigoto. Además, se observaron otras dos variantes en el exón 1: c.-257G>C y c.-280_-279insG. El cambio c.1A>G se encontró también en estado heterocigoto en la hermana melliza y la abuela materna, lo que estableció que este cambio proviene de la línea materna. El origen del cambio c.792C>G no pudo establecerse debido a la falta de muestras de la familia paterna.
Ninguna de las variantes c.1A>G o c.792C>G se encontró en los 100 controles de la población local. La primera metionina de CLN8p está altamente conservada en todas las especies comparadas, a diferencia de la asparagina en la posición 264. El programa SIFT predijo ambas mutaciones como ‘perjudiciales’, PolyPhen las predijo como ‘probablemente perjudiciales’, y el programa Mutation Tester predijo ambas variantes como ‘patológicas’. La variante c.-280_-279insG en el exón 1 podría alterar el exonic splicing enhancer predicho 5’-GCAGAA-3’ entre las bases -280 y -275. De acuerdo con las recomendaciones de la Human Genome Variation Society, las mutaciones c.1A>G, p.? y c.792C>G, p.Asn­- 264Lys deberían considerarse con significación patológica. Por otro lado, no fue posible confirmar la patogenicidad de las variantes c.-280_-279insG y c.-257G>C.
La variante c.1A>G elimina el codón de la primera metionina; por lo tanto, mueve el origen de traducción ‘aguas abajo’, causando un corrimiento del marco de lectura y un nuevo codón de parada, lo que genera un péptido de 22 aminoácidos. Un análisis de BLAST posterior no reveló una secuencia homóloga confiable para este polipéptido (datos no publicados). De acuerdo con la nomenclatura de mutaciones de la Human Genome Variation Society, esta mutación debería codificarse como c.1A>G, p.?. Son necesarios análisis posteriores para confirmar la expresión de este péptido aparentemente no funcional. Ambas variantes patógenas se incorporaron a NCL-Resource, la principal base de datos de mutaciones relacionadas con lipofuscinosis neuronal ceroidea, y a ClinVar (n.º de acceso SCV000676930 y SCV000660961).

Discusión
La niña mostró un fenotipo congénito con dos variantes génicas en heterocigosis con significación patológica (exón 2 c.1A>G, p.? [rs143730802], y exón 3 c.792C>G, p.Asn264Lys [rs587779411]) (Fig. 3), y otras dos sin significación patológica (exón 1 c.-257G>C [rs71499040] y exón 1 c.-280_-279insG [rs71209699]).

Figura 3. Esquema del gen CLN8 y la proteína que indica la posición de ambas variantes patógenas encontradas en la paciente de este estudio.

La historia natural de la enfermedad se resume en la tabla en comparación con los fenotipos vIT y EPRM. El curso clínico se relaciona más con la forma vIT que con la EPRM, principalmente debido a su rápida evolución y a los movimientos mioclónicos. Los aspectos visuales no se examinaron. El inicio de los síntomas en el nacimiento es signo de un fenotipo congénito, el cual debe añadirse a los fenotipos aceptados para la enfermedad CLN8: vIT y EPRM [15]. Una relación genotipo/fenotipo congénito podría explicarse por la falta de expresión y disfunción de la proteína CLN8p. Hasta la actua­lidad, la enfermedad CLN10 (OMIM 610127) es la única forma de lipofuscinosis neuronal ceroidea congénita [16]. La variante c.1A>G se citó previamente en un caso de CLN3 (enfermedad de Batten, OMIM 204200), sin una descripción del curso clínico del paciente [17].
Ambas variantes con significación patológica resultan nuevas para la enfermedad CLN8. La variante c.1A>G, p.? en el exón 2 se describió previamente en estado heterocigoto en el gen CLN8 de cuatro individuos como parte de una cohorte analizada en proyectos de secuenciación masiva: 1000 Genomes, UK 10K y NHLBI GO Exome Sequencing Project. Sin embargo, esta variante no se ha descrito como asociada a la enfermedad CLN8.
Según nuestro conocimiento, esta niña es el primer caso en América Latina de la enfermedad CLN8. Se informó de dos hermanos con el fenotipo CLN8 vIT de Canadá. Otro caso de heterocigosis compuesta en el gen CLN8 (exon 2 c.1A>G, p.?/ exon 2 c.80T>C, p.Leu27Pro) se diagnosticó en Estados Unidos. Dos individuos sintomáticos de México y Argentina mostraron una variante heterocigota en CLN8, c.685C>G, p.Pro229Ala, y se les describió preliminarmente como sospechosos de la enfermedad CLN8 [18]. Posteriores análisis revelaron que esta variante de ADN es un polimorfismo local frecuente [19].
Individuos con el fenotipo CLN8 vIT [5,20,21] mostraron retraso en el desarrollo psicomotor a temprana edad (p. ej., comenzar a caminar después de los 15 meses o a hablar a los 3 años) y una progresiva pérdida de capacidades mentales y motoras más tarde, aproximadamente después de los 3,5 años. Todos fueron diagnosticados con el fenotipo CLN8 vIT, y tomaron como síntoma de inicio el que llevó a la consulta médica: marcha inestable, convulsiones, mioclonía o discapacidad intelectual. Previamente se discutió una correlación genotipo/fenotipo en CLN8 [5]. En concordancia con nuestros hallazgos, los pacientes que poseen síntomas neuro­lógicos congénitos deberían ser agrupados en un fenotipo diferente: la forma congénita de la enfermedad CLN8.
En conclusión, hemos identificado el caso índice de CLN8 congénito en América Latina causado por variantes genéticas en heterocigosis: una variante genética patológica (exón 2 c.1A>G, p.?) y una variante missense (exón 3 c.792C>G, p.Asn264Lys). Este caso expande la frontera de distribución de la enfermedad CLN8 a Argentina y amplía la información acerca de su espectro clínico, sumando un fenotipo congénito que debe sospecharse en recién nacidos con retraso psicomotor desde el nacimiento, dificultades del habla, síndrome convulsivo con posterior trastorno mioclónico del movimiento y ataxia.
La metodología de la reacción en cadena de la polimerasa y la secuenciación de Sanger ‘de gen en gen’ y ‘de exón en exón’ usada en este caso implicó mucho tiempo, con una deficiente relación coste-efectividad. Este estudio sugiere que el uso sistemático de herramientas analíticas de la tecnología de secuenciación de nueva generación podría acelerar el reconocimiento de casos desafiantes de trastornos neurodegenerativos poco frecuentes en recién nacidos. El esclarecimiento de estos casos por análisis clinicogenómicos puede postularse como el enfoque más apropiado debido al incremento en la cobertura de lectura genética, reduciendo el tiempo y la odisea diagnóstica de las familias.

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