Paciente de sexo masculino, producto del primer embarazo, con controles prenatales, buena evolución y parto vaginal espontáneo. Presenta esquema de vacunación completo sin reacciones anormales. A los dos meses de edad presentó enfermedad diarreica aguda más abscesos perianales recurrentes. A los 6 meses de edad presentó inflamación crónica del colon y colitis bacteriana producida por Salmonella sp, requirió hospitalización durante 3 semanas con tratamiento antibiótico. A los 3 años de edad consultó nuevamente porque presentaba cuadros gripales, infección en el tracto respiratorio inferior, eritema en la región perianal, síntomas dispépticos y adenopatía en la cadena cervical posterior. Un año más tarde comenzó a presentar forúnculos en la cara, dolor abdominal difuso, diarrea ocasional, hábito intestinal de 3 a 4 veces al día y absceso en la región perianal. Dentro de los antecedentes familiares, la madre relató presentar abscesos recurrentes desde los 17 años pero no recibe tratamiento médico.
Reducción de Nitroblue Tetrazolium (NBT)
Al paciente, su madre y el control sano se les tomaron muestras de sangre venosa periférica sin anticoagulante con una jeringa de 1 ml y se depositaron 6 gotas sobre un portaobjetos precalentado para incubar a 37°C durante 30 min en cámara húmeda, posteriormente las láminas fueron lavadas con PBS precalentado a 37°C para retirar el coagulo formado, después del lavado las muestras fueron incubadas nuevamente a 37°C y se cubrieron completamente con 2 ml de la solución de NBT (Sigma N-6876) 1 mg/mL, previamente mezclado con forbol miristato acetato (PMA) (Sigma Chemical Co.) 1 mg/ml a 37°C durante 12 min. Las láminas fueron fijadas con metanol, teñidas con safranina al 1% y visualizadas en microscopio óptico. Se contaron 200 neutrófilos en campo de inmersión (100X), la generación de radicales de oxígeno se evidenció por medio de la reducción del colorante NBT en células activadas con PMA, con la consecuente formación de precipitados de formazán de color azul oscuro. Más del 95% de los neutrófilos normales deben reducir el NBT.
Citometría de flujo con dihidrorodamina (DHR)
Se tomaron 4 ml sangre venosa periférica con EDTA del paciente, su madre y el control sano. 400 μl de sangre más 4 ml de una solución de lisis (Cloruro de amonio 8,3 mg/ml, bicarbonato de sodio 0,84 mg/ml y EDTA 0,5 M) se incubaron a 37°C durante 5 min, posteriormente fueron centrifugados a 200 g. El botón de células obtenido fue lavado con buffer HBSS (Hank's Buffered Salt Solution), se adicionaron 400 μL de una solución de trabajo (800 μ de buffer HBSS, 3,6 μl de DHR 123 29 mM (invitrogen) y 10 μl de una solución de catalasa-buffer HBSS 1X) y se incubó a 37°C durante 5 min. Para la estimulación de los neutrófilos se adicionaron 100 μL de PMA (Sigma Chemical Co.) 1 mg/mL y se incubó a 37°C durante 14 min. La activación del sistema NADPH oxidasa fue determinada por la fluorescencia generada por la DHR 123, producto de la oxidación de la DHR por el peróxido de hidrógeno. La medición fue realizada por citometría de flujo en un citómetro Becton Dickinson FACSCanto II.
Separación de células mononucleares de sangre periférica (CMSP)
Se tomaron 15 ml de sangre venosa periférica en tubo con heparina del paciente, su madre y el control sano. La muestra fue diluida en tampón PBS (proporción 1:2), esta mezcla fue depositada en un tubo que contenía Ficoll 1077 en una proporción 1:3 con respecto a la mezcla y se centrifugó a 650 g durante 20 min a temperatura ambiente, el anillo de células mononucleares obtenido fue extraído cuidadosamente y lavado con PBS, posteriormente se centrifugó a 340 g durante 10 min a temperatura ambiente. La pureza y viabilidad de las células se determinó por conteo en cámara de Neubauer a través de tinción con violeta de genciana y azul de tripano respectivamente. Las células aisladas tenían porcentajes de viabilidad y pureza superiores al 95%.
Extracción de ARN, síntesis de ADNc y PCR
El ARN fue extraído a partir de CMSP por el método de TRIzol (Invitrogen). El ADN copia (ADNc) fue obtenido a partir del ARN total por transcripción reversa utilizando el sistema ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen) de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Para el estudio del ADNc de gp91 phox se utilizó una estrategia en la que se amplificaron 3 regiones superpuestas con el fin de abarcar todo el exoma, para ello se utilizaron tres pares de cebadores que amplificaron las regiones comprendidas entre los exones 1-5, 3-9 y 7-13.

Las condiciones de la PCR fueron: 2 min a 95°C, 30 ciclos que incluían 95°C por 15 s, 63°C por 30 s (regiones 1-5 y 7-13) o 42°C por 30 s (región 3-9) y 72°C por 45 s, además de una extensión final a 72°C por 7 min. Los productos obtenidos fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, previamente mezclado con SYBR safe (invitrogen). Los fragmentos fueron de 450 pb para la región 1-5, 700 pb para la región 3-9 y de 900 pb para la región 7-13.
Extracción de ADN genómico y PCR
El ADN genómico (ADNg) fue extraído a partir de CMSP por el método de TRIzol (invitrogen) de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Utilizando Cebadores o primers específicos, se amplificó el exón 2 del gen CYBB incluyendo los bordes de los intrones 1 y 2. Las condiciones de la PCR fueron 2 min a 95°C, 30 ciclos que incluían 95°C por 15 s, 63°C por 30 s y 72°C por 45 s, además de una extensión final a 72°C por 7 min. Los productos obtenidos fueron analizados en gel de agarosa al 1,5% teñido con SYBR safe (invitrogen). El fragmento obtenido fue de aproximadamente 230 pb.
Polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP)
Se estudió el polimorfismo conformacional de los fragmentos generados por PCR del ADN genómico. Los productos amplificados más el buffer de carga (0,05% de azul de bromofenol, 0,05% cyanol xylene, 95% formamida y 20 mM EDTA) fueron desnaturalizados a 95°C por 5 min y puestos inmediatamente en hielo. Las muestras fueron corridas una electroforesis no denaturante (utilizando un gel de acrilamida al 12% disuelto en tampón TBE 10% de glicerol) utilizando 90 voltios a 10°C durante 10 h. El gel con los productos de AND fue fijado con ácido acético al 10% durante 30 min y teñido empleando una solución de nitrato de plata 0,1% y formaldehido 0,14% durante 30 min. El revelado se llevó a cabo utilizando una solución de carbonato de sodio 3%, formaldehido 0,15% y tiosulfato de sodio 0,02%. El perfil de migración de las bandas del paciente y de la madre fue comparado con el control sano.
Secuenciación
Los productos obtenidos por PCR tanto de ADNc como ADNg fueron secuenciados con técnicas estándares (Macrogen Inc. Seul, Korea). Las secuencias de pacientes y controles fueron comparadas con las secuencias normales a partir de los datos de GeneBank (Número de acceso NM_000397).
El presente estudio contó con la aprobación del Comité de Etica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia. Medellín-Colombia. La identidad de los sujetos de este estudio se mantiene en confidencialidad.