Se trata de un canino hembra de 10 años, mestizo siberiano, con antecedentes de infestación frecuente por garrapatas, proveniente de la ciudad de Arica, ciudad fronteriza con Perú. Presentaba cuadro de seis semanas de evolución con compromiso del estado general y anorexia, al que se sumó en el último mes sangrado bucal; la sintomatología no mejoró tras una terapia inicial con vitamina B y antimicrobianos (metronidazol y espira-micina). Sus dueños consultaron a un veterinario para solicitar su eutanasia debido a su deterioro progresivo. Al examen físico destacaban su decaimiento, palidez de las membranas mucosas, debilidad extrema, emaciación, sangrado gingival y hematomas múltiples.
Previo a la eutanasia se obtuvo una muestra de sangre para estudio, por sospecha clínica de ehrlichiosis. En los exámenes generales destacaba trombocitopenia de 30.000 plaquetas/mm3, (valores normales para caninos 150.000 a 500.000/mm3), anemia leve con hematocrito 32% y Hb 10,5 mg/dL, (valores normales para caninos Hto 37-55%, Hb 12-19,2 mg/dL), recuento de leucocitos de 8.000/mm3 (valores normales para caninos 6.000 a 17.400/mm3) y un discreto aumento de creatininemia y nitrógeno ureico. Se efectuó determinación de IgG anti-E. canis y anti-A. phagocytophilum mediante kit rápido inmunocromatográfico (SNAP 3Dx Plus Test, Idexx®, USA), ensayo que ha reportado una sensibilidad de 79,2% (IC 64,5-88,9), especificidad de 100% (IC 89,8-100) y una precisión de 89,3% comparada con la inmunofluorescen-cia como estándar de oro13. El suero del canino mostró un resultado positivo para E. canis y negativo para A. phagocytophilum.
Se extrajo ADN desde la muestra de sangre utilizando el kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega). Se realizó RPC utilizando los partidores EHR-OUT1 y EHR-OUT214 que amplifican el gen 16S ARNr de los géneros Ehrlichia y Anaplasma. La amplificación se realizó mediante el método de "touch down PCR", que consiste en 14 ciclos de denaturación por 30s a 95°C, anillamiento por 30s a 74,4°C (decreciendo la temperatura 0,5°C por ciclo) y extensión por 90s a 72°C14. Luego 19 ciclos de denaturación por 30s a 95°C, anillamiento por 30s a 67,4°C y extensión por 90s a 72°C, para terminar con una extensión final de 300s a 72°C utilizando 2,5 μL de ADN en un volumen final de reacción de 25 μL. El fragmento obtenido de aproximadamente 1.000 pares de bases se sometió a una nueva amplificación por RPC anidada utilizando partidores internos específicos para Ehrlichia spp GE2F y EHRL3-IP214. Para ello se utilizó 1 μL de la reacción anterior en un volumen final de 25 μL. La amplificación consistió en 35 ciclos de denaturación por 30 s a 95°C, anillamiento por 30 s a 50°C y extensión por 30 s a 72°C, para terminar con una extensión final de 300 s a 72°C. Se obtuvo la banda esperada de 120 pares de bases, que sugiere la presencia de Ehrlichia spp. Para identificar la especie de Ehrlichia se secuenció el producto de la primera RPC con el partidor reverso EHR-OUT2 obteniendo un fragmento de 210 pares de bases. Esta secuencia mostró homología de 100% con la cepa de E. canis (DQ915970.1) reportada en Perú en el año 200715. Se construyó un árbol filogenético basado en las secuencias del gen 16S ARNr utilizando el método del vecino más próximo (Neighbor-Joining); la matriz de distancia se calculó a través del método Kimura (two-parameter) con un análisis de confianza (bootstrap) de 1.000 replicaciones. El árbol filogenético se realizó utilizando el software MEGA 4.023.